AP最前沿急性胰腺炎传统胰蛋白酶原激活机

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（据Gastroenterology年10月报道题：释放至胞质中的组织蛋白酶B（CathepsinB）在急性胰腺炎中直接发挥诱导腺泡细胞死亡的作用.作者：RupjyotiTalukdar等）

实验背景

急性胰腺炎（AP）是一经典的炎症性疾病模型，其最初起源于腺泡细胞内所发生的一系列复杂的活动。前人的研究表明胰腺炎始发于溶酶体（lysosomes）与酶原（zymogens）的结合共定位（co-localization），两者结合之后水解激活CathepsinB，而激活状态的CathepsinB水解胰蛋白酶原（trypsinogen）得到胰蛋白酶（trypsin），而传统观点中认为激活状态的胰蛋白酶在胰腺腺泡细胞损伤中发挥关键的作用。近年来关于AP初始阶段腺泡细胞的损伤观点集中在细胞主要发生了凋亡与坏死，而从胰蛋白酶的激活到腺泡细胞损伤这其中的具体生理病理机制并不明确，另一方面，有研究证实CathepsinB能够直接诱导肝细胞以及一系列其他类型细胞发生凋亡。因此本研究旨在寻求AP过程中何种因素触发了细胞死亡并且探讨CathepsinB除了激活胰蛋白酶原之外是否发挥着其他未知的关键作用。

实验方法

本实验涉及到四种动物品系：雄性Wistar大鼠，WT小鼠(C57BL/6背景)，cathepsinB基因敲除小鼠(CTSB-/-)以及trypsinogenisoform-7基因敲除小鼠(T7-/-)。在体外实验中，腺泡细胞损伤主要是使用超极量（supramaximal）或者极量（maximal）的雨蛙素、胆囊收缩素(CCK)-JMV以及碳酰胆碱（carbachol）等诱导。并且在本研究中还使用了一系列的抑制剂：穿膜性cathepsinB抑制剂CA-me(10mmol/L)、非穿膜性cathepsinB抑制剂CA(20mmol/L)、trypsin抑制剂benzamidine(1mmol/L)、PI3激酶抑制剂Wortmannin(20nmol/L)或Ly(50mmol/L)以及钙离子螯合剂BAPTA-AM(20mmol/L)。

主要结果

（1）急性胰腺炎时CathepsinB被释放至胞质

在体外实验中，通过WB和酶联方法验证了在使用超极量的雨蛙素或碳酰胆碱刺激腺泡细胞损伤之后，胞质内CathepsinB浓度显著增高。而使用极量的雨蛙素或碳酰胆碱以及超极量或极量的胆囊收缩素(CCK)-JMV等均不能诱导这一升高效应的出现。为了在体内实验中验证这一现象，使用超极量雨蛙素或L-精氨酸诱导大鼠急性胰腺炎的出现，之后在大鼠体内提取原代腺泡细胞并使用SLO方法分离胞膜和胞质。同样地，在体内模型中也观察到胞质内CathepsinB显著上升的现象。之后研究者采用免疫荧光方法验证上述现象，在对照组大鼠胰腺组织中，CathepsinB呈点状荧光提示其主要定位在溶酶体内，而AP组大鼠的胰腺组织荧光染色中，CathepsinB呈显著更为分散的荧光，提示其已释放至胞质中。

左：体外实验；右：体内实验验证AP状态下CathepsinB被释放至胞质中。

免疫荧光：Control组：CathepsinB呈点状荧光（提示其主要定位在溶酶体内），AP组：CathepsinB呈显著更为分散的荧光（提示其已释放至胞质中）。

（2）释放至胞质中的CathepsinB主要来源于细胞内共定位细胞器（Co-localizedOrganelles）并且胰蛋白酶在这一释放过程中发挥关键作用

不同于单纯的溶酶体，对于共定位细胞器的定义是其同时含有溶酶体酶和淀粉酶等消化酶。本实验中，使用雨蛙素诱导的腺泡细胞损伤之后，胞质内淀粉酶以及胰蛋白酶浓度也显著升高，同时使用共定位抑制剂Wortmannin或Ly可以显著降低胞质内淀粉酶、胰蛋白酶以及CathepsinB的浓度。除此之外，HSP70蛋白的过表达以及钙离子被螯合会显著抑制细胞器的共定位过程，因此研究者也使用了热刺激诱导HSP70的表达和BAPTA-AM螯合钙离子两种途径共同证实了CathepsinB确实是来自于细胞内的共定位细胞器，而非单纯溶酶体本身。为了验证胰蛋白酶在CathepsinB释放至胞质中发挥的作用，研究者使用了WT小鼠和trypsinogenisoform-7(T7-/-)基因敲除小鼠，在使用雨蛙素刺激后，WT小鼠腺泡细胞胞质内CathepsinB浓度显著升高，而在T7-/-基因敲除小鼠腺泡细胞内不能观察到这一升高效应。此外，使用胰蛋白酶抑制剂benzamidine也能显著抑制CathepsinB的升高，因此一系列证据证实胰蛋白酶在CathepsinB的释放过程中发挥着关键作用。

腺泡细胞损伤后，共定位细胞器内容物淀粉酶、胰蛋白酶、CathepsinB等共同释放，共定位抑制剂Wortmannin或Ly、热刺激诱导HSP70的表达和BAPTA-AM螯合钙离子均可抑制这一释放过程。

T7-/-基因敲除小鼠腺泡细胞内不能观察到雨蛙素诱导的胞质内CathepsinB升高效应。

（3）CathepsinB能直接诱导腺泡细胞发生线粒体通路依赖的细胞凋亡

通过体内体外实验证实，腺泡细胞发生损伤时，caspase-3浓度显著增高，Apo-TRACE染色绿色荧光增强，而使用CathepsinB抑制剂CA-me或者trypsin抑制剂benzamidine可以显著抑制上述增高效应，提示CathepsinB和胰蛋白酶均对腺泡细胞的凋亡发挥关键作用。为了进一步验证两者的促凋亡效应，研究者使用外源性不同剂量梯度的CathepsinB或trypsin来替代雨蛙素来对腺泡细胞进行刺激，结果表明不同剂量的trypsin均不能诱导caspase-3的激活，而CathepsinB对caspase-3的激活呈剂量依赖性，由此表明CathepsinB而非trypsin直接诱导腺泡细胞发生凋亡。之后研究者使用WT,cathepsinB-/-(CBKO)和T7-/-(T7KO)mice来进一步验证，在WT小鼠使用雨蛙素刺激后，细胞活性显著降低同时caspase-3显著激活，而在CBKO和T7KO小鼠中均不能观察到上述效应。

CathepsinB抑制剂CA-me或者trypsin抑制剂benzamidine可以显著抑制caspase-3浓度显著增高以及Apo-TRACE染色绿色荧光增强效应。

不同剂量的trypsin均不能诱导caspase-3的激活，而CathepsinB对caspase-3的激活呈剂量依赖性。

CBKO和T7KO小鼠中不能观察到雨蛙素刺激诱导产生的细胞活性降低与caspase-3激活效应。

低剂量CathepsinB对腺泡细胞发挥的促凋亡效应是通过Bax,Bid激活--cytochromec释放—Caspases级联激活线粒体通路介导的。

（4）高剂量CathepsinB诱导腺泡细胞凋亡向细胞坏死转变

为了验证不同剂量CathepsinB对细胞发挥的效应，研究者使用了Leu-Leu-OMe(LLOMe)，不同剂量的LLOMe可以量化控制胞质内CathepsinB的释放，因此低剂量LLOMe诱导胞质内少量CathepsinB的释放，此刻可观察到caspase-3的激活提示细胞发生了细胞凋亡；而高剂量LLOMe诱导胞质内大量CathepsinB的释放，此刻caspase-3激活降低，而LDH释放增加，提示细胞主要发生坏死。

随着胞质内CathepsinB浓度增加，腺泡细胞死亡方式由细胞凋亡向细胞坏死转变。

实验结论

在实验性胰腺炎中，激活的胰蛋白酶主要发挥使共定位细胞器脆弱易漏的作用，因此cathepsinB释放至细胞质中。低剂量的cathepsinB诱导线粒体内Bid的激活和cytochromec的释放，导致内源性通路介导的腺泡细胞凋亡。大剂量cathepsinB的释放主要诱导细胞发生坏死。

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报道：皋林

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